急性毒性试验/重复给药筛选试验

急性毒性评价是体内安全性评价的基本类型之一，药品注册往往需要进行急性毒性评价。急性毒性试验的数据在安全性评价中有着特殊的作用，可以在最初的毒性描述中确定MTD或MFD。在这些试验中得到的数据可以为安全药理学试验以及重复给药毒性试验的剂量选择提供依据。急性毒性试验还可用于早期候选药物的筛选，或者与简单的重复给药毒性试验同时运用。应注意的是，只有获得了基于暴露途径和临床适应症的生物利用度和系统暴露的资料，才能为急性毒性研究提供有价值的信息。

（一）急性毒性（重复给药筛选试验）
急性毒性试验可以有多种形式，但其主要目的是相同的，即测试所筛选的药物在临床剂量的若干倍数下能被耐受。筛选试验的好处在于可以在同一试验中同时比较几个候选药物。耐受性指标[如体重和（或）饲料消耗的变化以及异常的临床症状]可以为确定哪种候选药物提供更好的参考依据。此时动物品种的选择一般不要求是全部动物品种，但至少评价一种啮齿类动物。对于预定期每天服用的药物，在5~7天的暴露周期内对重复给药进行评价也是合理的。这有助于初步评价临床病理学终点的潜在改变，并且对于其他毒性试验项目的剂量选择也是有用的，但它不能替代急性毒性试验进行注册申请提交。

（二）急性毒性试验的基本设计包括每组动物数量相对较少的数个剂量组。对于啮齿类动物试验，每个剂量组每个性别5只动物是足够的。第二种动物品种一般使用2~3只动物。应设溶媒对照组至少3个供试品剂量组。剂量组也可以再增加，尤其是在进行急性毒性试验时对其毒理学概况知之甚少的情况下。在单次给予供试品后，体重、饲料消耗量和临床观察室获悉毒理学作用的关键性数据。在给药指定的天数后对存活动物给予安乐死（通常是给药后第14天）。大体解剖旨在对组织和器官的肉眼可见病变进行评估。但在大多数情况下对这些组织不再做进一步的组织病理学检查。毒性评价一般仅限于观察明显的毒性反应，如体重变化、饲料消耗量减少和（或）死亡、病态和供试品的药理学左右等临床观察。急性毒性试验资料可为随后的重复给药毒性试验的剂量设计提供参考。

服务项目：

考察受试药物对小鼠的 LD50 或最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）。
半数致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起 50%受试动物死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量。

服务内容：

1、 小鼠急性毒性预试验，确定合理剂量设计
2、 可根据受试药物特点选择合适的给药途径，包括灌胃、静脉注射、腹腔注射、皮下注射等
3、 对部分可疑动物进行病理组织学检查

客户提供：受试样品;

我们提交：详细实验报告;

服务周期：根据实验方案确定，请咨询;

服务收费：根据实验方案确定，请咨询;

服务特点：1.通过预实验确定给药剂量及组间剂量比；2.不同给药途径满足不同受试药物测定需要。

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一、概述

动物急性毒性试验（Acute toxicity test，Single dose toxicity test），研究动物一次或24小时内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应。拟用于人体的药物通常需要进行动物急性毒性试验。急性毒性试验处在药物毒理研究的早期阶段，对阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。急性毒性试验所获得的信息对长期毒性试验剂量的设计和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。
急性毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据化合物的结构特点、理化性质、适应症特点和试验目的等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。
急性毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复。

二、基本概念

最大无毒性反应剂量：即未见毒性反应剂量（No observed adverse effect level,NOAEL），指受试物在一定时间内，按一定方式与机体接触，用灵敏的现代检测方法和观察指标未发现损害作用的最高剂量。
最小毒性反应剂量：动物出现毒性反应的最小剂量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受试动物死亡的最高剂量。
最小致死剂量（Minimal lethal dose, MLD）：引起个别受试动物出现死亡的剂量。
半数致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起50%受试动物死亡的剂量。该值是经统计学处理所得的结果。

三、研究内容

（一）受试物
急性毒性试验的受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。
（二）动物
1.种属：不同种属的动物各有其特点，对同一药物的反应会有所不同。啮齿类动物和非啮齿类动物急性毒性试验所得的结果，无论是质还是量上均会存在差别。从充分暴露受试物毒性的角度考虑，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获得较为充分的安全性信息。因此，急性毒性试验应采用至少两种哺乳动物。一般应选用一种啮齿类动物加一种非啮齿类动物进行急性毒性试验。若未采用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应阐明其合理性。
2. 性别：通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。若采用单性别动物进行试验，则应阐明其合理性。
3. 年龄：通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童或可能用于儿童，建议必要时采用幼年动物进行试验。
4. 动物数：对于所用的动物数，应根据动物的种属和研究目的来确定。动物数应符合试验方法及其结果分析评价的需要。应在获得尽量多信息的前提下，使用尽量少的动物数。
5. 体重：动物初始体重不应超过或低于平均体重的20%。
可根据试验目的及受试物的特点，确定实验动物的性别和年龄等。动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。
（三）给药途径
给药途径不同，受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同，因此需要采用不同给药途径进行急性毒性试验。另外，通过对不同途径给药所得结果进行比较，可以获得一些初步的生物利用度信息。通常，给药途径应至少包括临床拟用途径和一种能使原形药物较完全进入循环的途径（如静脉注射）。如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此一种途径即可。经口给药前动物一般应进行一段时间（通常一夜）的禁食，不禁水。因为胃内容物会影响受试物的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响到药物代谢酶的活性和受试物肠道内吸收，从而影响毒性的暴露。
（四）给药剂量水平
急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。可选择适当的方法进行急性毒性研究，对于非啮齿类动物给予出现明显毒性的剂量即可，给药剂量没有必要达到致死水平。
总体上，给药剂量应从未见毒性剂量到出现严重毒性 (危及生命的) 剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。
不同动物和给药途径下的最大给药容量可参考相关文献及实际情况来确定。
（五）观察时间及指标
给药后，一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死动物前各称重一次，观察期间可多次称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。
（六）病理学检查
所有的试验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均应记录并进行组织病理学检查。

四、数据分析及评价

（一）结果处理和分析
1.根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量－反应及时间－反应关系。
2. 判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。
3.根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查应附有病理学检查负责人签名和药品注册申请人盖章的报告及有病变组织的病理照片。
4.根据不同剂量组各种毒性反应及发生率、动物死亡情况等，确定动物对受试物的无毒性反应剂量和严重毒性反应剂量。为此，建议采用适当的试验方法来测定最大无毒性反应剂量或最小毒性反应剂量，最大耐受剂量或近似致死量或最小致死剂量等，以初步判断受试物的安全范围。
5. 对于需要测定LD50的药物，应采用合理的统计学方法对其进行求算。
6. 说明所使用的计算方法和统计学方法，提供所选用方法合理性的依据。
（二）综合评价
根据各种反应在不同剂量下出现的时间、发生率、剂量-反应关系、不同种属动物及实验室的历史背景数据、病理学检查的结果以及同类药物的特点，判断所出现的反应与药物作用的相关性。总结受试物的安全范围、出现毒性的严重程度及可恢复性；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查的结果，初步判断毒性作用靶器官。
急性毒性试验的结果可作为后续毒理研究剂量选择的参考，也可提示一些后续毒性研究需要重点观察的指标。此外，根据不同途径给药时动物的反应情况，初步判断受试物的生物利用度，为剂型开发提供参考。

五、急性毒性试验常用试验方法

由于受试物的化学结构、活性成分的含量各异，毒性反应的强弱也不同，研究者应根据受试物的特点，选择以下方法或国内外公认的试验方法。
1. 近似致死剂量法
该方法主要用于非啮齿类的动物试验。试验方法如下：
一般采用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年龄一般为4-6 月龄，猴的年龄一般为2-3 岁，选用其他动物时应说明理由。
根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。
根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。

2. 最大给药量法
对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24 小时内多次给药(剂量一般不超过5g/kg 体重)，观察动物出现的反应。一般使用10-20 只动物，连续观察14天。

3. 固定剂量法（Fixed-dose procedure）
该方法最初于1984 年由英国毒理学会提出，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。
试验选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量；若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。
在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg 引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。
给受试物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给予受试物前、后各1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进行评价。

4. 上下法（阶梯法，序贯法，Up and down method）
该方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce又进行了改进，目前是OECD和EPA推荐的方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。
限度试验：是最多用5 只动物进行的序列试验。试验剂量为2000 mg/kg，特殊情况下也可使用5000 mg/kg。
2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物给予1 只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，动物总数为5只。如果1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价: 有3 只或3 只以上动物死亡时，LD50小于2000mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于2000 mg/kg；如果有3 只动物死亡，则进行主试验。
5000mg/kg剂量水平的限度试验:特殊情况下，可考虑使用5000mg/kg的剂量。将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，将受试物给予另外2只动物。如果这2只动物都存活，则LD50大于5000mg/kg，停止试验（即不再对其他动物给药，观察14天）。如果这2只动物中有1只死亡或者2只均死亡，将受试物给予另外2只动物，一次1只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有3只或3 只以上动物死亡时，LD50小于5000 mg/kg；有3 只或3 只以上动物存活时，LD50大于5000 mg/kg。
主试验:由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药1只动物，间隔至少48小时。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔可以适当调整，但使用单一时间间隔时，试验会更简便。
第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率2的级数因子为3.2），并应在整个试验过程中保持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求时1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。如果没有受试物的致死估计值，应该从175mg/kg开始。如果预期动物对该受试物的耐受程度变化很大（即，估计斜率小于2.0），那么开始试验前应考虑增加剂量级数因子超过按对数剂量计算的默认值0.5（即，级数因子为3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。
在决定是否及如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察达48小时。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区间。 用最大可能性法计算LD50值 (美国EPA开发了相应的计算软件，AOT425StatPgm)。
当满足下列停止试验标准之一时，停止试验：
（a） 连续3 只动物存活；
（b） 任意连续6 只试验动物中有5 只连续发生存活/死亡转换；
（c） 第一只动物发生转换之后至少有4 只动物进入试验，并且其LD50估算值的范围超出临界值（2.5 倍）。（首次转换的第4 只动物之后，对每次给药进行计算）。
对于LD50和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用4~6只动物即可满足停止试验标准（C）。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达15 只）。

5. 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要8 只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。
剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。
当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物5-7 天，以确定后续的重复给药试验中高剂量的选择。

6. 半数致死量法
是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50。