肿瘤细胞迁移是恶性肿瘤最重要的特征之一，瘤细胞由其原发部位侵入血管或淋巴管或体腔，部分细胞被血液、淋巴液带到另一部位或器官，在该处繁殖生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤，这一过程即为肿瘤的侵袭和转移。

    目前检测肿瘤细胞迁移的方法主要有细胞划痕实验及Trans-Well小室迁移实验，传统的细胞划痕实验需要连续观测以评估药物对细胞迁移的作用，因此，其面临的最大的问题是不能保证每次观察的都是同一位点，对结果不能进行定量分析，也不能区分划痕内的细胞是迁移还是增殖的而来的。而Trans-Well小室迁移实验虽能定量检测细胞迁移的数量，但不能直观观测细胞迁移过程，也不能将迁移和增殖细胞区分出来，而且其价格昂贵，不适合抗肿瘤细胞迁移药物的大规模筛选。

细胞迁移实验介绍

细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

    Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

Transwell孔径的选择

※共培养实验：在选择膜孔径的时候需要考虑实验的目的和实验细胞的大小，当膜孔径小于3μm的时候，细胞不会迁徙通过，所以如果不涉及研究细胞运动能力，应选择3μm以下的，通常是0.4μm或者3μm，例如在共培养体系研究细胞B分泌或代谢产物对细胞A的影响，就可以把A种在上室里，将B种在下室。
※趋化性实验：可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
i.细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
ii.趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

肿瘤细胞迁移实验（transwell migration）

常用8.0μm（8μm孔径的膜为文献中用来做侵袭和转移实验最常用的规格，本次订购的是Corning公司的用来做transwell migration的8μm孔径的24孔板transwell insert以及用来做transwell invasion的BD公司的8μm的24孔板铺胶transwell chamber）、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。FBS是最常用的趋化因子，本实验也准备选用FBS作为迁徙和侵袭实验的趋化因子。

肿瘤细胞侵袭实验（transwell invasion）

    常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

细胞迁移实验步骤

1、Transwell 小室的制备

    ※Corning公司的8μm孔径无胶24孔板transwell insert

               i. 预平衡：在24孔板中和transwell小室中加入培养液，在37℃的培养箱里平衡一个小时或者过夜，这样能够增强细胞的粘附作用。

               ii. 正式使用：24孔板中加入含5-10%FBS的培养液0.6ml，将transwell inset 放入板中（用镊子），在transwell insert中加入无血清的培液0.1ml。（操作手册提示：实验过程中，培液的高度需要定时的去观察，当需要维持要求高度的时候可以补加新鲜培液） 

    ※BD公司的8μm孔径铺有基层胶的24孔板transwell chamber

               i.再水化：从-20℃中取出并打开包装置于室温，往transwell小室以及24孔板中各加入37℃的培液0.5ml，然后置于37℃，5%CO₂培养箱中孵育2h使得基质胶再水化。

               ii.再水化后：小心的将培液吸走，注意别触到基质胶。

2、制备细胞悬液

            i. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

            ii. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－5×10⁵个/ml，具体的细胞密度需进行预实验，migration与invasion的细胞密度也有所不同（细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。）

3、接种细胞

          i. 取细胞悬液体积V1加入Transwell小室，不同规格Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，参考说明书。Corning公司24孔板transwell insert中加入的体积为0.1ml，BD公司的铺胶24孔板transwell insert中加入的体积为0.5ml。

          ii.24孔板下室一般加入体积V2含FBS的培养基（FBS浓度需进行预实验），不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。特别注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

          iii. 常规培养12－48h，时间点的选择需考虑到细胞侵袭能力、趋化因素和细胞数目等。

          iv.  注意事项

       l  需要考虑转oligo之后与NC相比，会不会对细胞的增值以及凋亡产生影响，如果转oligo后能抑制细胞增值以及促进细胞凋亡的话，那需要关注MDA-231侵袭能力的下降是因为细胞数目的减少还是因为确实转移和侵袭能力下调了（是否需要加一个什么都不转的对照组?）

    l  时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从oligo的转入到进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程，所以时间太短效应不明显，但是时间的延长不能影响到细胞增值的改变。

    l  细胞在小室内的形态有可能不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，属正常现象（别人的经验，注意观察）

    l  在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但如果出现了大气泡，一定要去除，否则严重影响实验结果。最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

4、结果统计

    ※去除基层胶和未侵袭出胶的细胞（参照BD公司的操作手册）

          i.  去除transwell小室中的培养液

          ii. 用干净的湿棉签，轻柔地但是均一用力擦除小室膜上表面的基质胶以及未侵袭出胶的细胞（invasion），或者擦除未转移跨膜的细胞（migration）。

          iii.  用第二根湿棉签重复一次

注意：整个过程应该尽量快的完成，以免膜下表面的细胞干掉。

    ※细胞固定与染色

          i. 结晶紫染色法：先固定后染色，各文献中固定方法不一，大致有以下几种:100%甲醇固定10min、4%的多聚甲醛固定15min或者100%乙醇固定10min。固定完之后用0.1%的结晶紫染色染30min。该方法为文献中最常用的方法（订购结晶紫试剂）

          ii. 瑞氏染色法：同样是先固定，可以选用100%甲醇固定10min，随后用瑞氏染液即A液一倍体积混合B液2倍体积后染色相应时间。该染色方法文献中使用较少，所以染色时间有待摸索，根据小赵师兄之前的经验应该在20分钟以上。

          iii. 使用BD公司的Diff-Quik staining kit：这个方法文献中也有使用，操作步骤严格按照BD公司的使用手册，但是须购买BD公司kit，较贵。

    ※ 细胞计数

         i.用锋利的刀片将膜从小室中分离下来，具体是先将刀尖插入膜与小室的边缘处形成一个小口，然后让小室逆着刀口的方向旋转，这样膜就被分离开来，当剩下少许连接的时候用镊子以尽量少的接触面积夹在膜上，最终将剩余的膜分离。

         ii.事先准备好一块载玻片，在上面滴一滴油，将分割下来的膜有细胞面朝上用镊子置于油上，随后再在膜上滴加一滴油，盖好盖玻片后，置于显微镜下拍照计数。

注：细胞计数可以用显微照相装置拍下几个具有代表性的视野然后进行计数，也可以直接在显微镜下计数，前者较优。

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