SARS-CoV-2是一种有包膜的单链RNA 病毒，病毒RNA通过核糖体移码产生两个多聚蛋白：pp1a和pp1ab。多蛋白由木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL pro）处理，其切割3个位点释放非结构蛋白nsp1-3和一种3C样蛋白酶，也称为主要蛋白酶（M pro）。在11个位点切割以释放非结构蛋白，这些非结构蛋白形成复制酶复合体，负责病毒基因组的复制和转录，因此使得M pro和PL Pro成为抗病毒药物开发的主要目标。
结构生物学可以起到药物开发的关键作用，但直接靶向SARS-CoV-2的药物仍然令人难以捉摸。近日，《Nature Communications》上的一篇新论文概述了一个国际研究团队如何确定潜在的方法，以快速设计出与COVID-19对抗的改进且功能更强的化合物。研究人员通过结合质谱和X射线方法对SARS-CoV-2主蛋白酶进行了大规模的亲电试剂和非共价片段筛选病毒复制，晶体学屏幕确定了覆盖整个活动位点的71个匹配以及二聚体界面的3个匹配。这些组合提供了前所未有的结构和反应性信息，可用于正在进行的针对SARS-CoV-2主蛋白酶结构的药物设计。
Part 1
M pro以无配体形式结晶，衍射至接近原子分辨率
不含配体的M pro的晶体结构适合X射线片段筛选（来源：Nature Communications）
晶体形式非常适合晶体碎片筛查，尽管蛋白晶体的溶剂百分比非常低，但是仍然存在清晰的通道可以通过扩散进入活性位点。此外，当向结晶液滴中添加可溶解的碎片时，紧密堆积和牢固的先天衍射平均晶体可抵抗晶格破坏和DMSO溶剂对衍射的降解。
Part 2
结合MS和晶体学碎片筛查揭示了M pro的新结合剂
结晶碎片屏幕的时间线（来源：Nature Communications）
为了确定共价起点，研究人员使用完整蛋白质谱法筛选了先前描述的针对Mpro的约1000个轻度亲电片段库。含有化合物N-（chloroacetyl）aniline基序是频繁击打者，因为这样的化合物是高反应性的。因此，研究人员选择反应性相对较低的系列成员进行后续结晶尝试，对于包含N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的另一系列命中化合物，它们显示较低的反应性并且在以前的筛选中不经常发生击打。
虽然温和的亲电片段非常适合探测活性位点半胱氨酸周围的结合特性，但它们的小尺寸却阻止了对底物结合的广泛探索。研究人员进行了另一次晶体学碎片筛查，以详尽地探查Mpro活性位点，并寻找碎片合并或生长的机会。将68个亲电子片段命中以及来自7个文库的总共1176个独特片段添加到晶体中，非共价片段被浸泡，而亲电试剂片段既被浸泡又被共结晶，以确保在结构上观察到尽可能多的质谱图。总共1742次浸泡和1139次共结晶实验产生了1877个镶嵌晶体，尽管有些碎片破坏了晶体或衍射，但仍然收集到了1638个分辨率高于2.8Å的数据集。
Part 3
非共价片段命中揭示了活性位点中的多个可靶向亚位点
研究人员共鉴定出八个片段结合在S1亚位点上，并通过吡啶环或类似的含氮杂环与关键残基的侧链形成相互作用，通过酰胺或脲部分中的羰基与Glu166形成相互作用。与其他亚位点相比，亚位点S2先前已显示出更大的灵活性，可适应肽基抑制剂中较小的取代基，但会优先选择亮氨酸或其他疏水残基。许多片段在此位置结合，研究人员称其为“芳香轮”，是因为芳香环的一致基序与Met49形成疏水相互作用，或与His41形成π-π堆积，基团分别在4个轴向上放置。
结合的片段对活动位点进行了全面采样（来源：Nature Communications）
在探索亚位点S3的四个片段中，其中三个片段带有一个磺酰胺基的芳环，该磺酰胺基与Gln189形成氢键，并朝着溶剂界面指向活性位点，这些命中具有适合利用上述相同的His164 / Met165 / Asp187口袋的扩展载体。
已经确定，对于类似的病毒蛋白酶如SARS-CoV的-1蛋白酶的生物学单元是二聚体，并且在突变二聚体界面可以破坏蛋白酶活性，因此干扰二聚化的化合物可能充当蛋白酶活性的准变构抑制剂。在这项研究中，三种化合物结合在二聚体界面的可及位置，可以想象到利用它们来设计化合物来破坏M pro二聚体。
二聚体界面的片段表示变构调节的机会（来源：Nature Communications）
片段Z1849009686（×1086）结合在由Met6、Phe8、Arg298和Val303的侧链形成的疏水口袋中，它还介导了两个氢键与Gln127的侧链和Met6的骨架。Z264347221（×1187）类似地结合在由Met6，Phe8和Arg298制成的疏水性口袋中，延伸穿过二聚体界面以与第二个原发性蛋白的Ser123、Tyr118和Leu141相互作用，包括氢键Ser123的侧链和主干。最后是POB0073（x0887），在二聚体界面处仅与Gly2结合4Å，被包裹在一个前体的Lys137和Val171之间，而另一个包裹在Gly2、Arg4、Phe3、Lys5和Leu282之间，包括两个与Phe3骨架相连的氢键。
Part 4
共价片段命中揭示了几个易处理的系列
在所有具有亲电试剂结合的结构中，N-氯乙酰基羰基氧原子与Gly143、Ser144或Cys145的骨架酰胺氢形成两个或三个氢键，包含N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的所有三种化合物都采用类似的指向S2口袋的结合方式。
共价片段锚定在Cys145处并取样正构M pro结合袋的不同区域（来源：Nature Communications）
一系列含有N-氯乙酰基哌啶基-4-羧酰胺基序的化合物显示出了有前途的结合模式。为了跟踪这些化合物，研究人员进行了第二代化合物的快速合成。通过N-氯乙酰基哌啶-4-羰基氯与各种内部胺（优选带有发色团以简化纯化）的反应，可以以毫克级获得这种化学型的衍生物。这些新化合物通过完整蛋白质质谱法测试，以评估蛋白质标记。源自非极性胺的酰胺大多胜过其极性对应物，这暗示了在该方向上可靶向的亲脂性亚区域。两种具有最高标记的PG-COV-35和PG-COV-34的酰胺突出显示了分别通过酰胺N-烷基化或交叉偶联进一步合成衍生化的潜力。
突出显示的结构-活性关系对于进一步优化很重要。溴炔具有固有的硫醇反应性，它比已建立的基于丙烯酰胺的共价抑制剂的固有硫醇反应性低。炔烃的几何形状及其结合方式也表明，可以用可逆的共价基团（例如腈）代替，它可以通过相同的非共价相互作用进行引导。两个共价命中物（2-氰基嘧啶和2-氰基咪唑）来自小型杂环亲电子试剂库，它们实质上是由五元和六元氮组成，含具有吸电子特性的杂环，可激活小的亲电子取代基（卤素，乙基，乙烯基和腈基）。
Part 5
结果与讨论
本研究提供的数据为从SARS-CoV-2开发有效的M pro抑制剂提供了许多明确的途径。结合的片段全面采样了活性位点的所有子位点，揭示了不同的扩增载体，并且亲电试剂为设计共价化合物提供了系统的和偶然的广泛数据。人们普遍认为，新的小分子药物不能以足够快的速度开发出来以帮助对抗COVID-19。然而，由于大流行病威胁仍将是一个长期问题，并且候选疫苗不能保证提供全面和持久的保护，因此抗病毒分子将仍然是重要的防御线，这类化合物还需要与未来的流行病作斗争，此项研究得出的数据将加速此类工作进展。
总的来说，共价命中提供了低反应性和高选择性抑制剂的合理途径。合理设计的共价药物获得牵引力，许多最近FDA批准的药物，它们的设计是基于非常有效的非共价结合，即允许低反应性亲电的精确定位，所以共价键的形成即是结合位点特异性的依赖。碎片方法已成为现代药物发现的一种主要方法，使用了少量化合物（ < 300Da）的小集合 （100s或1000s ），这些化合物杂乱地结合在一起，因此比HTS获得的化学空间要大得多。面临的挑战是，片段击中的结合非常弱，需要高度灵敏的生物物理检测，对结合的仔细确认以及专业的化学知识才能将这些击中并发展为完全有效的候选药物。但真正的希望是可以将它们快速有效地转化为有效的候选药物，并通过更简单的途径将其转化为临床药物。
世界上的焦点一直放在疫苗和现有药物的再利用上，但是该项研究是少数尝试新型小分子疗法的项目之一。该研究团队采取了极为不同寻常的途径，即在生成所有实验数据后立即将其发布，因此结果将可供全球任何一家药品制造商使用。国际社会对此项研究数据实时发布的反应更为出色，纷纷调动了大量的专业知识、技术和慈善事业，并演变成一种独特而严格的药物发现工作旨在迅速开发出具有良好安全性和临床前特性的的口服抗病毒药物。pg电子娱乐作为新药研发CRO也会持续关注此项研究进展。
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